Laporan Praktikum Uji Aktivitas Enzim Proteolitik

Glosaria.com - Percobaan Uji Aktivitas Enzim Proteolitik bertujuan untuk menentukan aktivitas enzim proteolitik (papain). Prinsip kerja pada percobaan ini yaitu ekstraksi padat cair dan titrasi formol. Ekstraksi padat cair merupakan proses pemisahan zat dari padatan dengan pelarut yang sesuai. Titrasi formol memiliki prinsip menetralkan larutan dengan basa NaOH membentuk dimethilol dengan penambahan formaldehid yang mana gugus amino sudah terikat dan tidak mempengaruhi reaksi asam basa NaOH.

PRAKTIKUM BIOKIMIA
“UJI AKTIVITAS ENZIM PROTEOLITIK”

A. Tujuan

Menentukan aktivitas enzim proteolitik (papain).

B. Dasar Teori

1. Enzim

Enzim merupakan katalisator protein yang mempercepat reaksi kimia dalam makhluk hidup atau dalam sistem biologis. Sebagai protein, enzim memiliki sifat-sifat umum protein. Enzim terdenaturasi pada suhu tinggi atau kondisi lainnya. Beberapa oksidator, keadaan polaritas larutan, tekanan osmotic yang abnormal juga dapat menghambat kerja enzim (Suhartono, 1989).

2. Enzim Proteolitik

Enzim proteolitik adalah enzim yang dapat memecah molekul-molekul protein dengan cara menghidrolisis ikatan peptide menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti pepton, polipeptida, dipeptida, dan sejumlah asam amino (Reed, 1975).

Protease merupakan enzim yang sangat kompleks, mempunyai sifat-sifat katalitik yang sangat bervariasi. Enzim ini dihasilkan secara ekstraseluler oleh mikroorganisme dan mempunyai peranan yang sangat penting dalam metabolisme sel dan mempunyai peranan yang sangat penting dalam metabolisme sel dan keteraturan dalam sel (Ward, 1983).

3. Enzim Protease

Enzim protease yang sering dijumpai dalam bentuk kasar dan murni, baik dari hewan atau tumbuhan dan digunakan dalam pengolahan bahan makanan. Enzim protease dapat dihasilkan dari tanaman diantaranya adalah papain dan bromealin. Papain merupakan enzim protease yang dihasilkan oleh buah pepaya (Reed, 1975).

Berdasarkan dari letak pemutusan ikatan peptide, protease dibedakan menjadi endopeptidase dan eksopeptidase. Endopeptidase memutuskan ikatan peptide yang berada dalam rantai protein sehingga dihasilkan peptide dan polipeptida. Sedangkan eksopeptida menggunakan protein dari ujung rantai sehingga dihasilkan satu asam amino dan sisa peptide (Ward, 1983).

4. Enzim Papain

Papain adalah suatu enzim yang dapat diperoleh dari getah tanaman pepaya dari buah pepaya muda. Getah pepaya tersebut terdapat hampir di semua bagian dari tanaman pepaya, kecuali bagian akar dan biji. Kandungan papain paling banyak terdapat dalam buah pepaya yang masih muda. Getah pepaya (papain) cukup banyak mengandung enzim yang bersifat proteolitik (pengurai protein) (Warisno, 2003). Getah pepaya mengandung sebanyak 10% papain, 45% kimopapain, dan lisozim sebesar 20% (Winarno, 1993).

Enzim papain adalah enzim protease yang dapat membentuk struktur primer protein, yaitu ikatan antar asam amino pada rantai polimer asam amino. Enzim ini tergolong protease sulfhidril dan mengandung unsur yang cukup besar (1,2%). Asam-asam amino penyusun papain antara lain lisin, arginine, asam aspartate, asparagine, asam glutamate, glutamin, tesnin, serin, prolin, alanine, valin, isoleusin, leusin, tirosin, fenil alanine, triptofan, sistein, dan sistin (Wirahadikusumah, 1989).

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim papain sebagai berikut:

a. Konsentrasi enzim

Enzim papain mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis ikatan peptide dari protein. Tingginya konsentrasi enzim yang digunakan akan mempengaruhi banyaknya substrat yang dapat ditransformasi. Konsentrasi enzim yang berlebihan akan menyebabkan proses tersebut menjadi tidak efisien. Derajat kemurnian enzim papain yang tinggi mempunyai hubungan linier dengan jumlah enzim dan taraf aktivitas (Lehninger, 1997).

b. Suhu

Reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat peka terhadap suhu. Enzim sebagai protein akan mengalami denaturasi pada suhu yang tinggi sehingga mengakibatkan daya kerja enzim tersebut menurun (Girindra, 1993).

Enzim akan semakin aktif apabila suhu dinaikkan atau sampai suhu optimumnya. Namun bila suhu tersebut terus dinaikkan maka laju kerusakan enzim akan melampaui reaksi katalis enzim sehingga menyebabkan reaksi tidak efisien. Suhu optimal papain yaitu 50-60^oC. papain relatif tahan terhadap suhu apabila dibandingkan dengan enzim proteolitik lainnya (Winarno, 1993).

c. pH

Derajat keasaman (pH) sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim karena sifat ionik gugus karbonil dan gugus amino mudah dipengaruhi oleh pH. Aktivitas enzim papain cukup spesifik karena papain hanya dapat mengkatalisis proses hidrolisis dengan baik pada kondisi pH serta suhu dalam kisaran waktu tertentu. Papain mempunyai pH optimum 7,2 pada substrat BAEE (benzoil arginil etil ester), pH 6,5 pada substrat kasein, pH 7,0 pada albumin, dan pH 5,0 pada gelatin (Muchtadi, 1982).

d. Pengaruh inhibitor (faktor penghambat)

Inhibitor adalah suhu senyawa atau gugus senyawa yang menghambat aktivitas enzim. Enzim sangat peka terhadap senyawa atau gugus senyawa yang diikatnya. Enzim papain sangat sensitif terhadap logam. Adanya logam akan merusak gugus sulfhidril yang merupakan gugus katalitik enzim papain (Girindra, 1993).

C. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah water bath, gelas ukur 50 mL, gelas beaker 250 mL, pipet volume 10 mL, pengaduk, pipet tetes, blender, penyangga, statif, buret, erlenmeyer, neraca analitik, corong, bola hisap, dan botol akuades.

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah buah pepaya muda, susu skim 5%, formaldehida, kertas saring, indikator pp, NaOH 0,1 N, dan akuades.

D. Cara Kerja

Langkah kerja yang pertama adalah ekstraksi enzim papain. Buah pepaya muda sebanyak 75 gram dipotong kecil-kecil lalu ditambahkan 150 mL akuades. Kemudian dihaluskan menggunakan blender. Setelah semuanya halus disaring menggunakan penyaring Buchner lalu filtrat dibuat tiga konsentrasi, yaitu 10, 30, dan 60%.

Langkah kerja yang kedua adalah uji aktivitas enzim papain. Susu skim 5% diencerkan dengan 160 mL akuades kemudian dimasukkan ke dalam 4 erlenmeyer masing-masing 40 mL. E₁, E₂, E₃, E₄ dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 37^oC selama 10 menit. E₁, E₂, E₃ ditambahkan 10 mL ekstrak enzim papain dan E₄ ditambahkan 10 mL akuades. E₁, E₂, E₃, E₄ diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37^oC. Masing-masing erlenmeyer ditambahkan 2 mL formaldehid dan 2 tetes indikator pp kemudian dititrasi dengan NaOH.

E. Data Hasil Pengamatan

1. Ekstraksi enzim papain

No.	Cara Kerja	Hasil Pengamatan
1.	75 gram buah pepaya muda dipotong kecil-kecil	Massa = 75,5013 gram
2.	Ditambahkan 150 mL akuades	Volume = 150 mL
3.	Dihaluskan menggunakan blender
4.	Disaring menggunakan penyaring buchner	Warna filtrat = hijau muda
5.	Filtrat dibuat tiga konsentrasi yaitu 10, 30, 60%

2. Uji Aktivitas Enzim Papain

No.	Cara Kerja	Hasil Pengamatan
1.	Susu skim 5% diencerkan dengan 160 mL akuades	Massa = 5,0033 gram Volume = 160 mL
2.	Dimasukkan ke dalam 4 erlenmeyer (E₁, E₂, E₃, E₄) masing-masing 40 mL
3.	E₁, E₂, E₃, E₄ dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 37^oC selama 10 menit
4.	E₁, E₂, E₃ ditambahkan 10 mL ekstrak enzim papain dan E₄ ditambahkan 10 mL akuades
5.	E₁, E₂, E₃, E₄ diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37^oC
6.	Ditambahkan 2 mL formaldehid + 2 tetes indikator pp
7.	Dititrasi dengan NaOH

	Volume titrasi (mL)			Volume rata-rata (mL)
	I	II	III	Volume rata-rata (mL)
E₁	0,95	0,975	0,95	0,95
E₂	1,10	1,15	1,10	1,11
E₃	1,00	1,15	1,05	1,06
E₄	0,95	0,90	0,85	0,9

F. Pembahasan

Percobaan yang dilakukan berjudul Uji Aktivitas Enzim Proteolitik. Tujuan dari percobaan ini yaitu untuk menentukan aktivitas enzim proteolitik (papain). Prinsip kerja pada percobaan ini yaitu ekstraksi padat cair dan titrasi formol. Ekstraksi padat cair merupakan proses pemisahan zat dari padatan dengan pelarut yang sesuai. Titrasi formol memiliki prinsip menetralkan larutan dengan basa NaOH membentuk dimethilol dengan penambahan formaldehid yang mana gugus amino sudah terikat dan tidak mempengaruhi reaksi asam basa NaOH.

Enzim papain pada percobaan ini diperoleh dari pepaya muda. Enzim papain merupakan enzim protease yang berasal dari pepaya baik di daun, buah, maupun akarnya. Enzim papain berperan aktif dalam proses hidrolisis ikatan peptide.

Percobaan ini adalah dengan mengekstraksi enzim papain. Jenis ekstraksi yang dilakukan yaitu ekstraksi padat cair. Enzim papain diperoleh dengan mengisolasi getah pepaya muda karena buah pepaya memiliki kandungan enzim papain yang paling banyak daripada bagian yang lainnya. Buah pepaya muda dipotong kecil-kecil dan ditambahkan akuades bertujuan untuk mempengaruhi penghalusan. Penghalusan bertujuan untuk mengekstrak pepaya dan diperoleh filtrat dari buah pepaya yang merupakan ekstrak kasar enzim. Setelah dihaluskan dilakukan penyaringan berwarna hijau muda. Filtrat kemudian diencerkan menjadi tiga variasi konsentrasi yaitu 10, 30, 60%. Pengenceran bertujuan untuk memperkecil konsentrasi filtrat. Variasi konsentrasi bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi terhadap kecepatan reaksi dari enzim.

Percobaan kedua yang dilakukan yaitu menguji aktivitas enzim papain. Susu skim 5% diencerkan dengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam empat buah erlenmeyer. Suhu skim 5% digunakan sebagai substrat yang akan dihidrolisis oleh enzim protease dengan bantuan air menjadi peptide dan asam amino. Keempat erlenmeyer dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 37^oC selama 10 menit untuk mengkonstankan suhu susu skim supaya enzim dapat bekerja dengan optimal. Kemudian ketiga erlenmeyer ditambahkan masing-masing 10 mL ekstrak papain dengan konsentrasi 10% untuk erlenmeyer 1 (E₁), konsentrasi 30% untuk erlenmeyer 2 (E₂), konsentrasi 60% untuk erlenmeyer 3 (E₃), dan akuades untuk erlenmeyer 4 (E₄) sebagai larutan blanko. Kemudian keempat erlenmeyer dimasukkan ke inkubator untuk diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37^oC. inkubasi dilakukan agar enzim bekerja secara optimum pada saat hidrolisis protein. Enzim protease relatif stabil pada suhu -37-60^oC dalam waktu 60 menit. Kenaikan suhu akan mempercepat reaksi hingga suhu optimum tercapai dan mencapai maksimum. Kasein yang terdapat pada susu skim apabila direaksikan dengan enzim papain dengan bantuan air akan memutus protein dalam kasein menjadi asam amino penyusun kasein.

Setelah diinkubasi masing-masing erlenmeyer dipindah ke tiga erlenmeyer kecil dan ditambahkan formaldehid. Penambahan formaldehid bertujuan untuk mereaksikan dengan larutan asam amino bebas yang terdapat dalam larutan kasein. Asam amino bebas apabila direaksikan dengan formaldehid akan membentuk derivat methilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas kehilangan satu protein dari gugus NH₃⁺ sehingga bersifat asam.

Kemudian ditambahkan indikator pp tidak terjadi perubahan warna atau tetap berwarna putih. Hal ini menunjukkan tidak adanya larutan bersifat asam karena indikator pp akan menunjukkan tidak adanya perubahan warna pada pH asam. Indikator pp berfungsi untuk menentukan titik ekuivalen karena indikator ini akan berubah warna di sekitar titik ekuivalen dan merupakan indikator yang sesuai. Kemudian dilakukan titrasi dengan NaOH 0,1 N dan terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang menandakan larutan bersifat basa dan telah mencapai titik akhir reaksi.

Berdasarkan percobaan diperoleh volume rata-rata titrasi untuk erlenmeyer 1 (E₁) sebesar 0,95 mL, erlenmeyer 2 (E₂) sebesar 1,11 mL, erlenmeyer 3 (E₃) sebesar 1,06 mL, dan erlenmeyer 4 (E₄) sebesar 0,9 mL. Berdasarkan perhitungan diperoleh aktivitas enzim protease pada konsentrasi 10% yaitu 1,15.10^-5, konsentrasi 30% yaitu 4,88.10^-5, dan konsentrasi 60% yaitu 3,71.10^-5. Berdasarkan teori, pada konsentrasi substrat tertentu kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim atau semakin tinggi konsentrasi maka aktivitas enzim semakin besar. Pada percobaan ini aktivitas enzim pada konsentrasi 30% lebih besar daripada konsentrasi 60%. Hal ini terjadi karena pada saat titrasi untuk konsentrasi 30% membutuhkan volume titrasi yang lebih banyak untuk terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Pada larutan blanko tidak terjadi aktivitas enzim karena larutan tidak mengandung enzim papain yang memecah ikatan peptide pada kasein.

G. Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa aktivitas kerja dari enzim dipengaruhi oleh konsentrasi substrat dari enzim, pH, dan suhu. Aktivitas enzim pada konsentrasi 10% yaitu 1,15.10^-5, konsentrasi 30% yaitu 4,88.10^-5, dan konsentrasi 60% yaitu 3,71.10^-5. Semakin besar konsentrasi enzim, aktivitas enzim semakin meningkat.

H. Daftar Pustaka

Girindra, Aisjah. 1993. Biokimia I. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.
Lehninger, A. L. 1997. Dasar-dasar Biokima. Jakarta: Erlangga.
Muchtadi, T. R. dan Sugiono. 1992. Ilmu Pengetahuan Bahan Pangan Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Bogor: IPB.
Reed, G. 1975. Enzymes in Food Processing. New York: Academic Press.
Suhatono, M. T. 1089. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: IPB.
Ward, O. P. 1983. Proteolitic Enzyme. New York: Peegamon Press.Warisno. 2003.
Budidaya Pepaya. Yogyakarta: Kanisius.
Wanirno, F. G. 1993. Pengantar Teknologi Pangan. Jakarta: Gramedia.
Wirahadikusumah, M. 1989. Biokima (Protein, Enzim, Asam Nukleat). Bandung: ITB.